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線粒體是動植物細胞生成ATP的主要地點，是促進細胞能量轉(zhuǎn)換、參與細胞凋亡的重要細胞器。線粒體在呼吸氧化過程中，將所產(chǎn)生的能量以電化學(xué)勢能儲存于線粒體內(nèi)膜，在內(nèi)膜兩側(cè)造成質(zhì)子及其他離子濃度的不對稱分布而形成線粒體膜電位(Mitochondrial membrane potential，MMP，ΔΨm)。正常的MMP是維持線粒體進行氧化磷酸化、產(chǎn)生三磷酸腺苷的先決條件，MMP的穩(wěn)定有利于維持細胞的正常生理功能。

線粒體亞顯微結(jié)構(gòu)

線粒體是細胞能量和新陳代謝的重要調(diào)節(jié)者，對維持細胞的生長和存活起著至關(guān)重要的作用。線粒體的核心功能是通過氧化磷酸化合成ATP，這就是眾所周知的線粒體生物能量學(xué)。而ATP的產(chǎn)生，是與線粒體膜電位有關(guān)的。線粒體通過由電子傳遞鏈產(chǎn)生的膜電位梯度來維持氧化磷酸化，從而驅(qū)動ATP的合成。這一步是通過位于線粒體內(nèi)膜的質(zhì)子泵完成的，質(zhì)子泵可以將基質(zhì)內(nèi)質(zhì)子（H+）泵入膜間隙，質(zhì)子的跨膜轉(zhuǎn)運使線粒體膜間隙積累大量質(zhì)子，形成跨線粒體內(nèi)膜的跨膜電位，即線粒體膜電位。當(dāng)質(zhì)子返回時便推動生命體最重要的能量貨幣ATP的產(chǎn)生，人體的ATP有95%為線粒體所提供。

正常情況下，線粒體內(nèi)膜電位較高，保持在負電位，而外膜電位較低，保持在正電位。當(dāng)某些因素導(dǎo)致線粒體呼吸鏈電子傳遞過程障礙，影響基質(zhì)內(nèi)質(zhì)子（H+）跨膜梯度的形成，就會導(dǎo)致外正、內(nèi)負的線粒體膜電位下降，即去極化。大量研究表明，線粒體膜電位下降與自噬、凋亡或壞死等有關(guān)。線粒體膜電位功能障礙，甚至細微的異常變化，都可能極大地影響細胞內(nèi)的生物活性，引起各種疾病（阿爾茨海默病、糖尿病和癌癥等）。

線粒體膜電位示意圖

因此，線粒體膜電位是評價線粒體正常功能的重要指標之一，不僅反映了線粒體功能的完整性，對ATP的合成、離子的轉(zhuǎn)運、細胞凋亡的調(diào)控以及抗氧化作用都具有重要的影響，同時也反映了細胞的健康狀況，對細胞的生存和發(fā)展具有重要的意義。另外，檢測線粒體膜電位的變化對生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)診斷也具有重要意義。所以，我們應(yīng)該重視線粒體膜電位的變化，并采取相應(yīng)的措施來保護線粒體的正常功能。

JC-1 是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位的理想熒光探針，可以用來檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位。在線粒體膜電位較低時，JC - 1 不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時 JC - 1 為單體，最大發(fā)射波長為 527 nm，可以產(chǎn)生綠色熒光；在線粒體膜電位較高時，JC-1 聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，最大發(fā)射波長為590 nm，可以產(chǎn)生紅色熒光。這樣就可以非常方便地通過熒光顏色的轉(zhuǎn)變來檢測線粒體膜電位的變化。

JC-1進入線粒體和聚集物生成的示意圖

Rhodamine 123 是一種可透過細胞膜的陽離子綠色熒光染料，可作為線粒體膜電位的指示劑，其在正常細胞中能夠依賴線粒體膜電位進入線粒體基質(zhì)，熒光強度弱。而在凋亡發(fā)生時，線粒體膜完整性破壞，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運孔開放，引起線粒體膜電位的降低，Rhodamine 123 重新釋放出線粒體，從而發(fā)出強黃綠色熒光，廣泛用作檢測線粒體膜電位的熒光探針，并且對細胞沒有任何毒性。

TMRM（四甲基羅丹明甲酯）/TMRE （四甲基羅丹明乙酯）是一種陽離子細胞滲透型熒光染料，易與活躍的線粒體螯合，是可用能斯特方程定量測量膜電位的優(yōu)選染料。染料不會在細胞膜中形成聚集體，并且與膜蛋白具有最小的相互作用。因此，根據(jù)能斯特方程，染料的跨膜分布與膜電位直接相關(guān)。

它們除了可以選擇性的對線粒體進行染色外，與JC-1一樣，TMRM和TMRE也廣泛地用于線粒體膜電位的測定。這兩種特殊的羅丹明酯將線粒體染色，帶有橙色熒光。它們的光譜特征與TRITC相似，這是TMRM和TMRE使用起來非常方便。TMRE的疏水性比TMRM略微強一點。

MitoScene TM Red CMXRos 是一種紅色熒光染料，含有氯甲基官能團，可標記線粒體。只需與活細胞簡單孵育即可被動運輸穿過細胞膜并直接聚集在活性線粒體上，該染料的積累取決于膜電位的高低。一旦線粒體被染色后，還可根據(jù)后續(xù)實驗的需求用醛類固定劑進行固定。對于免疫組化及原位雜交實驗，細胞需先經(jīng)過透化，MitoScene TM Red CMXRos 還可染色透化細胞的線粒體。該染料適合雙標記實驗，其紅色熒光與其他的綠色熒光探針可以很好的區(qū)分開來。可以染死細胞。

4-Di-1-ASP 是苯乙烯基染料，用于染色活細胞線粒體。它也被用于染色神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞、活體大腦組織等。在顯微鏡成像時可發(fā)出綠色熒光 (λex /λem = 475/606 nm)。

DASPEI 是一種苯乙烯基染料，可以染色活細胞的線粒體。DASPEI 的激發(fā)和發(fā)射波長在 550/573 nm，熒光壽命強，靈敏度高。DASPEI 可以對活細胞中的線粒體進行染色，具有良好的標記性，也可獨立于神經(jīng)元活性用于突觸前神經(jīng)末節(jié)的染色。

MitoSceneTM Green I是一種線粒體綠色熒光染料，可在納摩爾水平對線粒體進行染色標記，該染料具有質(zhì)膜透性，且在線粒體膜上積累而呈現(xiàn)明亮的熒光。該染料在線粒體中的定位不依賴于線粒體膜電位，染色固定細胞信噪比不理想，在細胞固定、透化之后，會導(dǎo)致熒光信號減弱或丟失，所以我們推薦只用來染活細胞。

10-壬基吖啶橙（NAO）是吖啶橙的衍生物， 是一種用于完整細胞內(nèi)線粒體特異性熒光標記物。與Rh123相比，細胞中NAO的積聚與質(zhì)子動力驅(qū)動關(guān)系不大，但是與線粒體相關(guān)膜蛋白或者脂類發(fā)生作用相關(guān)。NAO的攝入不依賴于線粒體跨膜電勢差，可用于檢測線粒體。NAO可與心磷脂等帶負電荷磷脂特異性結(jié)合， 其與線粒體膜的相互作用不依賴于線粒體的膜電位；分析細胞凋亡時， 可用羅丹明123來檢測線粒體的膜電位， 而用NAO來檢測線粒體結(jié)構(gòu)的完整性。NAO和羅丹明123（Rh123）是研究線粒體功能一對好的染料。