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百瑞極——免疫學基礎實驗--ELISA(1)

ELISA的歷史

ELISA的發展起點要追溯到RIA（radioimmunoassay）的歷史，Yalow和Berson在1960s第一次使用碘標記的RIA技術來測定內源血漿中的胰島素水平，然而放射性實驗安全風險太高，不適合進行大面積推廣應用，這時候一些科學家便想用生物酶來代替放射性標記，但如何將酶與抗體或抗原連接而不影響彼此的生物活性成為了必須要捅破的窗戶紙，盡管在當時被普遍認為是不可能的實驗，Perlmann和Schuurs 還是在1966年力證了酶連接的免疫試驗是可行的，直到1971年，Perlmann和Schuurs兩個研究組幾乎同時發表了ELISA的文獻，向世人系統性的介紹了ELISA的方法，此后，ELISA經歷迅速的，直接開啟了商業臨床和醫療診斷的應用。

ELISA的實驗原理

ELISA是以免疫學反應為基礎，將抗原、抗體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結合起來的一種敏感性很高的試驗技術。

由于抗原、抗體的反應在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔（當然就是我們熟知的96孔板啦）中進行，每加入一種試劑孵育后，可通過洗滌除去多余的游離反應物，從而保證試驗結果的特異性與穩定性。

ELISA的類型

目前酶聯免疫吸附測定使用的最多的是檢測特異性的抗體或可溶性的抗原，因被檢測的物質可分為多類，且每次的結構與特征都不相同，所以為了提高靈敏度開發了不同類型的ELISA方法，主要分為四種：

（1）直接ELISA

這是Perlmann最早建立的ELISA方法，通常用于檢測分子量比較大的抗體或抗原，以及抗體篩選和抗原表位作圖，這個模式比較簡單，將抗原包裹在孔中，加入酶連接的特異性抗體，靶向固定化的抗原，成為牢固的復合體，洗去結合不緊密的抗體或背景蛋白后，加入合適的底物量，孵育使其發生特定的酶反應催化，產生顯色反應，通過檢測熒光信號來定量分析物。

Direct ELISA

Direct ELISA方法優缺點比較

（2）間接ELISA

由于受到direct ELISA方法的鼓舞，Lindstr?m和Wager在1978年發表了indirect ELISA方法，之所以叫indirect ELISA方法，是因為相對于direct ELISA，它引入了第二個抗體來進行檢測，與direct ELISA不一樣的是，它通過使用一抗能結合多個二抗，從而放大了檢測靈敏度，就好像在一個黑暗的房間，direct ELISA只有一個50W的燈泡，而indirect ELISA能接上兩個50W的燈泡，這樣房間的亮度是不一樣的。

Indirect ELISA

Indirect ELISA方法優缺點比較

（3）夾心法ELISA

這項ELISA技術是最受歡迎的，1977年，Kato和他的同事發明了這項結合direct與indirect ELISA 技術特點的經典方法，“sandwich”最明顯的特點就是特異性高，靈敏度高，試想去分辨身高長相完全一致的雙胞胎，你只熟悉并想找到其中一個人，然而單靠肉眼已經無法做出最正確的判斷了，這時候需要聽他們各自的聲音便來區分。Sandwich ELISA將一抗固定在孔表面，含目標抗原的測試樣被加入到孔中使其充分結合抗體，待洗去未結合的雜質后，加入酶標記二抗結合抗原的另一表位，形成“sandwich”的結構，這時候的抗原就像被兩個面包片夾著的奶油，通過酶催化發生顯色反應就可以測定抗原的含量。