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產品規格
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備注
BN20549-500ul/25T
500ul/25T
￥2800.00
BN20549-1ml/50T
1ml/50T
￥5200.00
產品描述
產品描述:偶聯 anti-HA tag 納米抗體的瓊脂糖珠用于免疫沉淀 HA tag（YPYDVPDYA）的融合蛋白。
產品優勢
? 沒有普通抗體的輕鏈和重鏈；
? 高親和力：解離常數達到 nM-pM 級別；
? 高載量：20ul 的 beads 懸液可以結合 2-5ug HA tag 的融合蛋白；
? 較短的孵育時間，結合 30-120 min 即可；
應用范圍
可用于免疫沉淀（IP）/免疫共沉淀（CoIP）、染色質免疫沉淀（ChIP）/RNA 結合蛋白免疫沉淀（RIP）、 酶活性測定、質譜分析等；
特異性
可以結合 HA tag 的融合蛋白。
產品特性
存儲緩沖液：PBS(含有 20%乙醇)。 保存條件：可在 4℃保存至少 1 個月，在-20 度或-80℃保存 1 年，避免高速離心，干燥和反復凍融。
實驗原理
實驗步驟：
收集細胞：
每個免疫沉淀反應大約使用 106-107 的哺乳動物細胞（約一個 10 厘米培養皿）表達綠色熒光蛋白融合蛋白。吸出生長培養基、向培養皿中加入 2 毫升預冷的 PBS 洗滌細胞 2 次，利用細胞刮或胰酶消化的方法收集貼壁細胞，細胞轉移到離心 管，500 g 離心 3-5 分鐘并丟棄上清液。
細胞裂解：
1．用 500 ul 預冷的裂解緩沖液重懸細胞，在裂解緩沖液中加入蛋白酶抑制劑（自備）。對于膜蛋白或核/染色質蛋白，可使用 RIPA 裂解液（貨號：BN25012）中加入蛋白酶抑制劑（貨號：BN25002）。
2．把離心管放置在冰上 30 分鐘，可以每 10 分鐘充分吹打一次。
3．細胞裂解產物在 4℃，20,000 g 條件下離心 15 分鐘，轉移裂解產物到一個新的預冷管中，丟棄沉淀。注意：此時細胞 裂解產物可以放在-80℃進行長期儲存。
平衡珠子：
4．振蕩混勻 HA tag-Nanobody-Agarose Beads，吸取 20ul beads 懸液到 500 ul 預冷的裂解緩沖液中，在 4 ℃，2,500 g 條件下離心 3 分鐘，丟棄上清液。（此步驟可選） 結合蛋白
5. 將細胞裂解產物加入到平衡的 HA tag-Nanobody-Agarose Beads 中（如果未做第 4 步，可在細胞裂解產物中直接加入 20ul beads 懸液），在 4 ℃冷柜中的旋轉混合儀上結合 30-120 min。如果需要，保存 50 ul 的裂解產物進行免疫印跡分析。
6. 在 4 ℃，2,500 g 條件下離心 3 分鐘，丟棄上清液。
清洗珠子：
7. 用 500 ul 預冷的裂解緩沖液中洗滌 HA tag-Nanobody-Agarose Beads，在 4 ℃，2,500 g 條件下離心 3 分鐘，丟棄上清液并重復洗滌 2 次。（可選：在第二次洗滌的步驟中增加鹽濃度到 500 mM）。
洗脫蛋白：
方法一：
8. 加入 20ul 2X SDS-sample buffer 重懸 HA tag-Nanobody-Agarose Beads。在 95℃條件下加熱 10 min，把免疫沉淀復合物從珠子上游離出來，然后在 4 ℃，2,500 g 條件下離心 3 分鐘收集上清，進行免疫印跡分析。
方法二：
9. 替代步驟 8 的可選步驟：加入 50ul 0.2 M pH2.5 的甘氨酸洗脫結合的蛋白，建議孵育時間 30 秒，并不斷混勻，隨后離心，轉移上清液到新管中，為了中和酸性的甘氨酸，需添加 5ul 1.0 M Tris（pH10.4）。注意：為了提高洗脫效率可以重復這一步。
方法三：
10. 替代步驟 8 或 9 的可選步驟：也可以加入過量的 HA tag 的多肽進行洗脫。
產品效果：
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